Introduzione
Immagina di aver appena eseguito una reazione di PCR e di aver ottenuto molte copie di una regione specifica di DNA. O forse hai eseguito una clonazione del DNA cercando di "incollare" un gene in un plasmide circolare di DNA. Ora vuoi verificare se la PCR ha funzionato correttamente o se il plasmide contiene il gene desiderato. Quale tecnica puoi utilizzare per visualizzare direttamente i frammenti di DNA?
Electroforesi in gel
L'elettroforesi in gel è una tecnica utilizzata per separare i frammenti di DNA (o altre macromolecole come RNA e proteine) in base alla loro dimensione e carica. L'elettroforesi consiste nell'applicare una corrente attraverso un gel che contiene le molecole di interesse. Sulla base della loro dimensione e carica, le molecole si sposteranno nel gel in diverse direzioni o a diverse velocità, separandosi l'una dall'altra.
Tutte le molecole di DNA hanno la stessa carica per unità di massa. A causa di ciò, l'elettroforesi in gel separa i frammenti di DNA solo in base alla loro dimensione. L'elettroforesi ci consente di vedere quanti diversi frammenti di DNA sono presenti in un campione e quanto grandi sono in relazione gli uni agli altri. Possiamo anche determinare la dimensione assoluta di un frammento di DNA confrontandolo con una "scala" standard di frammenti di dimensioni conosciute.
Cos'è un gel?
Come suggerisce il nome, nell'elettroforesi in gel viene utilizzato un gel: un blocco di materiale simile alla gelatina. I gel utilizzati per separare il DNA sono spesso composti da un polisaccaride chiamato agarosio, che viene ottenuto sotto forma di scaglie secche polverizzate. Quando l'agarosio viene riscaldato in una soluzione tampone (acqua mescolata con alcune sali) e lasciato raffreddare, si forma un gel solido leggermente morbido. A livello molecolare, il gel è una matrice di molecole di agarosio che sono tenute insieme da legami idrogeno e che formano piccoli pori. Su un'estremità, il gel presenta delle scanalature a forma di pozzi, dove verranno posizionati i campioni di DNA.
Prima di aggiungere i campioni di DNA, il gel deve essere posizionato in una camera. Un'estremità della camera viene collegata a un elettrodo positivo e l'altra estremità viene collegata a un elettrodo negativo. Il corpo principale della camera, dove viene posizionato il gel, viene riempito con una soluzione tampone contenente sali che possono condurre la corrente. Anche se potresti non vederlo nell'immagine (grazie alle mie favolose abilità artistiche), la soluzione tampone riempie la camera fino a un livello che copre appena il gel.
L'estremità del gel che contiene i pozzi viene posizionata verso l'elettrodo negativo. L'estremità senza pozzi (dove i frammenti di DNA migreranno) viene posizionata verso l'elettrodo positivo.
Come si muovono i frammenti di DNA attraverso il gel?
Una volta che il gel è nella camera, ogni campione di DNA che vogliamo analizzare (ad esempio, ogni reazione di PCR o ogni plasmide digerito con enzimi di restrizione) viene trasferito con cura in uno dei pozzi. Un pozzo viene riservato per il marcatore di peso molecolare, uno standard di riferimento che contiene frammenti di DNA di lunghezze conosciute. I marcatori di DNA commerciali coprono diversi intervalli di dimensioni, quindi cercheremo di utilizzare uno con una buona "copertura" nell'intervallo di dimensioni in cui ci aspettiamo di trovare i nostri frammenti.
Successivamente, viene applicata energia elettrica alla camera e inizia a fluire corrente attraverso il gel. I gruppi fosfato dello scheletro zucchero-fosfato conferiscono alle molecole di DNA una carica negativa, quindi iniziano a muoversi attraverso la matrice di gel verso il polo positivo. Quando il sistema è acceso e la corrente passa attraverso il gel, si dice che il gel stia "correndo".
I campioni di DNA vengono caricati nei pozzi all'estremità del gel più vicina all'elettrodo negativo. Si accende la fonte di alimentazione e i frammenti di DNA migrano attraverso il gel (verso l'elettrodo positivo). Quando il gel ha terminato la corsa, i frammenti si separano per dimensione. I frammenti più grandi si trovano vicino alla parte superiore del gel (dall'elettrodo negativo, dove hanno iniziato) e i frammenti più piccoli si trovano vicino al fondo (dall'elettrodo positivo).
Man mano che il gel corre, i frammenti di DNA più corti viaggeranno più velocemente attraverso i pori della matrice del gel rispetto ai frammenti più grandi. Dopo un po' di tempo di corsa del gel, i frammenti di DNA più corti saranno più vicini all'estremità positiva del gel, mentre quelli più lunghi rimarranno vicino ai pozzi. I frammenti di DNA molto piccoli potrebbero persino uscire dal gel se lo facessimo correre per troppo tempo.
Visualizzazione dei frammenti di DNA
Una volta che i frammenti si sono separati, possiamo esaminare il gel e determinare la dimensione delle bande presenti su di esso. Quando un gel viene colorato con un pigmento che si lega al DNA e viene esposto alla luce UV, i frammenti di DNA brillano, consentendoci di vedere il DNA presente in diverse posizioni lungo il gel.
Una "linea" ben definita di DNA su un gel viene chiamata banda. Ogni banda contiene un gran numero di frammenti di DNA della stessa dimensione che hanno viaggiato insieme fino alla stessa posizione. Un singolo frammento di DNA (o anche un piccolo gruppo di frammenti di DNA) non sarebbe visibile da solo su un gel.
Confrontando una banda in un campione con il marcatore di peso molecolare, possiamo determinarne la dimensione approssimativa. Ad esempio, la banda luminosa nel gel precedente ha una dimensione approssimativa di 700 paia di basi (pb).
Comprueba tu comprensión
Nel gel precedente sono numerate quattro corsie. (Una corsia è un percorso attraverso il quale il DNA esce da un pozzo). Quale corsia corrisponde alle seguenti descrizioni?
1234
- Questa corsia contiene il frammento di DNA più lungo.
- Questa corsia contiene il frammento di DNA più corto.
- Questa corsia contiene un frammento di DNA di 1500 paia di basi (pb).
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LabXchange è una piattaforma di educazione scientifica online gratuita creata presso la Facoltà di Arti e Scienze di Harvard e supportata dalla Fondazione Amgen.